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Advance

Kawakami Kyojiro

    Proteome Research　Researcher
Last Updated :2024/12/27

Researcher Information

URL

ORCID ID

J-Global ID

Research Interests

  • aging   extracellular vesicles   exosomes   

Research Areas

  • Life sciences / Molecular biology

Education

  • 2006/04 - 2009/03  Toho University  Graduate School of Pharmaceutical Sciences  博士後期課程
  • 2004/04 - 2006/03  Toho University  Graduate School of Pharmaceutical Sciences  博士前期課程
  • 2000/04 - 2004/03  Toho University  Faculty of Pharmaceutical Sciences

Association Memberships

  • 日本分子生物学会   日本生化学会   日本細胞外小胞学会   日本薬学会   日本基礎老化学会   

Published Papers

MISC

Research Grants & Projects

  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2024/04 -2027/03 
    Author : 加藤 卓; 水谷 晃輔; 川上 恭司郎
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2023/04 -2026/03 
    Author : 川上 恭司郎
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2023/04 -2026/03 
    Author : 大山 健一; 盛田 幸司; 川上 恭司郎
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2023/04 -2026/03 
    Author : 伊藤 雅史; 加藤 卓; 水谷 晃輔; 川上 恭司郎
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 基盤研究(C)
    Date (from‐to) : 2021/04 -2024/03 
    Author : 水谷 晃輔; 藤田 泰典; 加藤 卓; 川上 恭司郎
     
    本研究では、癌免疫を利用した新規治療法の開発を目的とした。免疫担当細胞であるリンパ球は癌細胞を攻撃する際にパーフォリンとグランザイムを分泌し、前者により細胞膜に孔を開け、後者によりDNAを切断して癌細胞を死滅させる。本研究ではパーフォリンを癌治療に応用するためのデータ収集を行った。パーフォリン発現遺伝子を癌細胞に導入し、癌微小環境においてパーフォリンリッチとし免疫細胞の癌攻撃能力を増強させることとした。遺伝子導入療法では、有害事象低減の必要性から癌細胞特異的なドラッグデリバリー法が求められるため、モデルとして組織特異的なタンパクであるProstate Specific Antigen（PSA）を発現する前立腺癌を使用した。前立腺癌細胞特異的にパーフォリンを発現させるため、PSAプロモーターによりパーフォリンを発現するベクターを作成し、これをリポソームに内包しPSAを発現しているドセタキセル耐性前立腺癌細胞株（22Rv1DR）とPSAを発現していない前立腺癌細胞（PC-3）に添加したところ、22Rv1DRのみでパーフォリンの発現を確認できた。ついでパーフォリン発現がヒトリンパ球による癌細胞増殖抑制に及ぼす効果を調べるため、22Rv1DRとヒト末梢血単核球（PBMC）と共培養を行った。PBMCと癌（22Rv1DR)細胞の共培養では増殖抑制効果は認められなかったが、パーフォリン発現ベクター内包リポソームを添加すると強い細胞増殖抑制効果が認められ、パーフォリンリッチな癌微小環境が癌免疫に好ましい影響を及ぼすことが明らかになった。ついで22Rv1DRをマウスに皮下接種し、パーフォリン発現ベクター内包リポソームを経静脈投与したところ有意な増殖抑制効果が認められ、パーフォリン発現ベクター内包リポソームの全身投与における癌増殖抑制効果が確認できた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 基盤研究(C)
    Date (from‐to) : 2021/04 -2024/03 
    Author : 加藤 卓; 水谷 晃輔; 川上 恭司郎
     
    近年、去勢抵抗性前立腺癌や転移を有する前立腺癌に対して多くの新規アンドロゲン除去療法や抗癌剤が保険適応となったが、薬剤投与前にそれらの治療効果を予測することは困難である。 本研究では細胞外小胞（エクソソーム）内のタンパクや核酸を解析することにより、体液生検により新規薬剤の治療効果予測を行い、個々の患者に適した薬剤を選択することを目的としている。 最初に新規薬剤の耐性に関与する候補マーカーを抽出するために、治療当初は新規アンドロゲン除去療法（アビラテロン）に感受性を示し、後に耐性を獲得した2名の去勢抵抗性前立腺癌の患者から、治療開始前と耐性獲得後に血清を採取し、エクソソームを単離した。単離したエクソソームよりtotal RNAを抽出し、RNA sequenceを行い治療開始前と耐性獲得後のmRNAとlong non-coding RNAの発現の変化を比較した。 次に前立腺癌に関与することが予想されるRNAを抽出するため、両患者に共通して5倍以上発現に変化を認めたRNAを対象に、TCGAのdatabaseを解析し、正常前立腺と前立腺癌の組織内でのRNAの発現量を比較し、RNA sequenceと同様に有意に発現の変化を認めたRNAを選択し候補RNAとした。 現在はdigital PCR法を用い、新規アンドロゲン除去療法を施行した去勢抵抗性前立腺癌及び、転移を有する前立腺癌患者の治療開始前の血清を用いエクソソームよりRNAを抽出し、候補RNAのcopy数を定量し、治療効果を予測できるかを検討中である。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2020/04 -2023/03 
    Author : 伊藤 雅史; 川上 恭司郎; 水谷 晃輔
     
    細胞から分泌されるエクソソームは由来する細胞の特徴を反映することから、体液中エクソソームは新たなタイプのバイオマーカーとして期待されている。本研究では、血清から単離したエクソソーム中のアミロイドベータ・リン酸化タウ蛋白の検出によりアルツハイマー病と対照の鑑別が可能かどうかを検証するとともに、プロテオーム解析を行い、新規診断マーカーの候補を同定する。続いて、マーカーの検出システム構築した後に多検体で解析を行い、アルツハイマー病・MCI（軽度認知機能障害）と対照症例の鑑別における臨床的有用性を検証することを目的としている。 今年度は個々の検体からエクソソームを精製し、ラベルフリーによる定量プロテオーム解析を行うことを試みた。昨年度と同様にフォスファチジルセリン（PS）アフィニティ法により血清からエクソソームを単離し、解析を行うことにしたが、その過程で精製に関しての疑義が生じたため、別法による血清からのエクソソーム精製の検討を行った。ヒトプール血清を使用し、PSアフィニティ法を含めて、別のアフィニティ精製法、サイズ排除クロマトグラフィー法などによりエクソソームを精製し、サンドイッチELISAやLC-MS/MS解析でエクソソームマーカーの検出具合などを比較した。今後は最も良い精製条件と考えられる方法を選択し、アルツハイマー病の検体を用いた解析を進めていく予定である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 基盤研究(C)
    Date (from‐to) : 2020/04 -2023/03 
    Author : 大山 健一; 盛田 幸司; 川上 恭司郎
     
    細胞から放出され体液中に存在するエクソソームは由来する細胞の特徴を反映していることから、様々な疾患で新たなタイプのバイオマーカーとして注目されている。本研究は、術後の免疫組織染色でしか知り得ないGH産生下垂体腺腫でのソマトスタチン受容体（SSTR）サプタイプの発現を、末梢血エクソソームの解析により測定するシステムを構築した後、術前後の患者の血清で測定し、組織でのSSTRの発現レベルとの相関を検討することにより、エクソソームによるソマトスタチンアナログ（SSA）の薬効予測診断の実現に向けた基盤的な知見を得ることを目的としている。 初期研究として、ヒト胎児腎細胞（HEK細胞）にソマトスタチン受容体２型（SSTR2）プラスミドを導入し、24時間エクソソームフリーの条件下で培養。培養液の上清を採取し, 上清から超遠心法によりエクソソームを単離した後、エクソソームマーカーに対する抗体（CD9、CD63等）を用いてウエスタンブロットを行い、エクソソームの単離を確認した。さらに単離を確認したエクソソームにおけるSSTR2の発現の有無を検討した。この際、最適濃度等の情報も十分でないため、まずはややタンパク量多め、抗体濃度高めにて行なったところ、エクソソーム内にSSTR2の発現が確認された。このため引き続き同実験系にて至適タンパク量及び至適抗体濃度の検討を行った。今後は引き続き下垂体腺腫細胞株（ラットGH3細胞）での検討を開始する予定で、同様な手法により、ラットGH3細胞エクソソーム内でのSSTR2の発現に関して検討を行うことを予定している。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 基盤研究(C)
    Date (from‐to) : 2020/04 -2023/03 
    Author : 川上 恭司郎
     
    認知機能の低下は超高齢社会の我が国では重要な問題の一つである。認知機能低下の早期のバイオマーカー開発には様々な取り組みが行われているが、実用化には至ってはいない。その原因として、横断研究における個人差が挙げられる。そこで、本研究では同一人物を長期追跡した縦断研究の検体を用い、個人差を抑えた探索研究を行う。具体的には、細胞から体液中に放出され、由来細胞の成分を内包する細胞外小胞を血漿から単離した後にプロテオーム解析を行い、従来の血漿全体の解析では見えなかった新規バイオマーカーの発見を目指す。 本年度は以下のことを行った。 細胞外小胞の精製の検討：前年度までに検討を行ってきた、ホスファチジルセリン（PS）アフィニティ精製法により血漿から高純度の細胞外小胞が回収可能と考えていたが、その後の検討により限られた性質をもつ細胞外小胞のみを回収しているのではないかという懸念が生じた。そのため、PSアフィニティ法以外の別のアフィニティ精製法やサイズ排除クロマトグラフィー法なども含めて細胞外小胞を精製し、サンドイッチELISAやプロテオーム解析での細胞外小胞マーカータンパク質の検出程度の比較を行い、最もよい条件の精製方法を検討した。今後は現状での最適な精製方法を選定し、個々の検体からの細胞外小胞の精製およびプロテオーム解析を進めていく予定である。
  • 尿エクソソームを利用した尿路感染症診断法の開発と感染メカニズムの解明
    Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2018/04 -2020/03 
    Author : 水谷 晃輔; 藤田 泰典; 堀江 憲吾; 仲野 正博; 伊藤 雅史; 川上 恭司郎
     
    本研究の目的は尿路感染症における尿エクソソームのマーカーとしての有用性や生体反応の解明手段としての有用性の検証である。本年度に実施した研究では以下の成果を得た。 尿路感染症において細菌や細胞外毒素であるLipopolysaccharide（LPS）と直接反応する尿路上皮細胞と単球系細胞のモデルとしてそれぞれSV-HUC-1とTHP-1を使用し、大腸菌とLPSとの共培養を行い、細胞から分泌されるエクソソーム内で増加するシグナル因子（protein kinase B：Akt、Extracellular Signal-regulated Kinase：ERK）と転写因子（nuclear factor-kappa B：NF-kB）を見出した。さらにこれらの発現はLPSよりも大腸菌との共培養で顕著であることを確認した。ついで、実際にこれらの因子のヒト尿中エクソソーム内での発現を検討するために、密度勾配遠心法を用いて尿路感染症患者の尿から精製したエクソソームの解析をおこなったところ、これらの因子がエクソソーム内にあることが確認できた。その中で発現量からAktの測定が最も信頼性が高いと考え、尿路感染症の治療前後で尿中エクソソーム内におけるAktの発現比較を行ったところ、治療後にその発現が低下することが確認でき、尿路感染症のマーカーになり得る可能性を見出した。この結果を元に、尿エクソソーム内のAktの発現が無症候性細菌尿と尿路感染症患者における診断マーカーになりうるかを検討するため、immuno-capture法を用いて尿エクソソームを単離し、AktとエクソソームマーカーであるCD9の発現を検討したところ、尿路感染患者においてはそれらの発現が有意に上昇しており、無症候性細菌尿との鑑別のためのマーカーになる可能性を見出した。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2016/04 -2019/03 
    Author : ITO MASAFUMI; HORIE kengo
     
    In the present study, we aimed to develop exosome-based diagnostic systems for prostate cancer (PC). First, we performed proteomic analysis of exosomes isolated from culture medium of PC cell lines and identified gamma-glutamyltransferase 1(GGT1) as a candidate marker for PC. We found that serum exosomal GGT activity was significantly higher in PC patients than in benign prostatic hyperplasia (BPH) patients, suggesting its potential for differential diagnosis of PC and BPH. Second, ＜本項目は特許出願予定であるので、現時点での公表を差し控える。＞
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2016/04 -2019/03 
    Author : Kawakami Kyojiro
     
    In the present study, we aimed to understand the characteristics of exosomes released upon neuroinflammation from microglia in brain. First, we performed proteomic analysis of exosomes released from cultured microglial cells after LPS stimulation and identified proteins whose expressions were altered by the treatment. Second, we confirmed that exosomes released from activated microglial cells activated naive microglial cells. Lastly, we modified and developed exosome isolation methods from mouse brain and also found that cell-specific exosomes can be isolated from mouse brain by the immunocapture method. These findings will provide a basis for understanding the role of exosomes released from microglia upon neuroinflammation.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
    Date (from‐to) : 2015/04 -2017/03 
    Author : Ito Masafumi; KAWAKAMI Kyojiro; FUJITA Yasunori; TANAKA Masashi; FUJISAKI Kento
     
    Exosomes that are secreted from cells reflect the molecular signature of cells from which they are derived. Therefore, exosomes are considered to be a novel type of biomarker as well as tool for intercellular communication. In the present study, we first improved the isolation method of exosomes from mouse frozen brain tissues. Then, we found that (1) exosomes can be isolated from human brain tissues, (2) brain exosomes consist of those derived from neuron and glial cells, and (3) brain exosomes isolated from the brain of Alzheimer’s disease patients contain amyloid beta, providing the basis for exosome research in human brain.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
    Date (from‐to) : 2014/04 -2016/03 
    Author : Kawakami Kyojiro
     
    Neuroinflammation is profoundly involved in neurodegenerative diseases. We aim to elucidate the role of exosomes secreted from activated microglia in neuroinflammation. We found that protein composition in exosomes secreted from BV-2 microglia cells was altered by LPS treatment, among which histone molecules showed a remarkable increase. Treatment with histone molecules damaged PC12 neuronal cells, but exosomes derived from LPS-treated BV-2 cells showed no apparent cytotoxic effect. Further investigation using differentiated PC12 cells or primary cultured neurons will be required to elucidate the role of histones expressed on exosomes in neuroinflammation.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2012/04 -2015/03 
    Author : KON Kazuyoshi; IKEJIMA Kenichi; KAWAKAMI Kyojiro
     
    To develop a new strategy of steatohepatitis to take the place of dietary and exercise treatment, we investigated the role of epigenetic alterations on the development of steatohepatitis, using mice (in vivo models) and primary-cultured mouse hepatocytes. In particular, we focused the relationship between endoplasmic reticulum (ER) stress and epigenetic changes in hepatocytes. First, we showed the possibility that the exercise by treadmill increased carnitine pool, followed by improving lipid metabolism and accelerating the effect of low fat diet feeding. Next, we revealed that increase of ER stress in liver induced epigenetic alteration in liver tissue, leading to hepatic fibrosis and carcinogenesis. Finally, we demonstrated that the anti-ER stress treatment with 4-phenylbuthyric acid ameliorated ER stress, followed by improving steatohepatitis in vitro and in vivo.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
    Date (from‐to) : 2012/04 -2014/03 
    Author : KAWAKAMI Kyojiro
     
    We studied anti-aging mechanism of exercise via protein acetylation. Aged rats were exercised on treadmill 60 min/day and 4 times per week, for 8 weeks. We analyzed changes of liver protein. 2D-DIGE (two-dimensional difference gel electrophoresis) showed 13 significantly changed protein spots (10 increased and 3 decreased) from a total of 662 spots. However, these spots were below two fold changes, and intensity of each spot was very weak. Protein acetylation of liver mitochondria decreased with age by western blot analysis with anti-acetyl lysine antibody, however, exercised rats increased acetylation of protein.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Research Activity start-up
    Date (from‐to) : 2010 -2011 
    Author : KAWAKAMI Kyojiro
     
    We analyzed anti-aging mechanism of exercise focused on histone modifications. We found dimethylation of histone H3 lysine 4 was decreased in rat gastrocnemius muscle. However, exercise didn’t affect histone modifications. In rat kidney, histone H3 lysine 9 acetylation and serine 10 phosphorylation was increased with age. Moreover, inflammatory genes mRNA were increased with age, and histone H3 lysine 9 acetylation was presented in the vicinity of the gene transcription start site.

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